CRISPR obtiene Loopy
19 de julio de 2017
Nathan Blow, PhD
En la búsqueda por comprender la estructura de la cromatina, los investigadores han desarrollado un nuevo método para crear y eliminar bucles de cromatina a demanda. Lee mas...
Modelo artístico de la organización de la cromatina tridimensional en el núcleo que muestra la cromatina en forma de lazo.Fuente: http://www.biology.emory.edu/research/Corces/Research2.html
El primer paso para comprender nuestro genoma fue descifrar sus 3,2 mil millones de nucleótidos. Cuando la secuencia de referencia humana se publicó por primera vez, nos dio nuevos conocimientos sobre nuestros genes y las diversas regiones reguladoras que controlan su expresión. Pero resulta que la secuencia por sí sola no es suficiente para descifrar todo el funcionamiento interno de nuestro genoma: la forma en que el ADN se retuerce, gira, gira y enrolla también es críticamente importante.
Dentro de la célula, el ADN se envuelve alrededor de las histonas y se empaqueta en enormes complejos de ADN y proteína conocidos como cromatina. La estructura de la cromatina es cada vez más interesante para los investigadores, ya que la forma en que se empaqueta el ADN se relaciona directamente con la forma en que se transcribe y, por lo tanto, qué proteínas se producen y dónde y cuándo.
La parte engañosa ha sido el desarrollo de métodos para explorar regiones de ADN genómico que, a primera vista, pueden parecer distantes, pero que de hecho interactúan entre sí. Los científicos han confiado en técnicas tales como la captura de conformación cromosómica (3C), que utiliza enlaces cruzados y resúmenes para identificar interacciones espaciales dentro de la cromatina, o una variedad de enfoques de secuenciación de próxima generación (ChIP-seq, ATAC-seq, DNase-seq) identificar los estados de cromatina en todo el genoma.
Si bien estos métodos han arrojado información valiosa sobre la estructura de la cromatina y las interacciones, la capacidad de manipular la cromatina directamente y determinar los efectos de esta manipulación sería un medio poderoso para comprender la importancia de la estructura del ADN. Con esto en mente, los investigadores de la Universidad de Stanford se propusieron desarrollar una técnica para crear, o incluso eliminar, bucles de cromatina rápidamente (1).
Solución basada en CLOuD
El investigador de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford Kevin Wang y sus colegas querían encontrar un método simple pero robusto para inducir el bucle de la cromatina en las células bajo demanda. El objetivo era poder manipular la arquitectura nuclear de forma que se pudieran evaluar experimentalmente las hipótesis sobre regiones interactivas y cómo se generan y mantienen los ciclos de cromatina.
Para probar las interacciones entre dos secuencias genómicas, Wang y su equipo primero necesitaban encontrar una forma de dirigirse específicamente a esas regiones de interés y luego inducir una conexión entre los sitios objetivo. Para resolver el primer desafío, los investigadores recurrieron a una herramienta que proporciona especificidad de orientación genómica con un amplio rango de host: el sistema CRISPR / Cas9.
El equipo de Wang utilizó un Cas9 deficiente en nucleasa (dCas9) que, junto con un ARN guía, actuaría como un "vehículo de orientación" capaz de dirigirse a regiones muy específicas del genoma y llevar una carga útil. Dado que dCas9 es deficiente en nucleasas, no habría edición del genoma en las células que lo expresan, solo se dirigiría.
Para que la carga útil genere bucles de cromatina, los investigadores aprovecharon dos dominios de proteínas dimerizables (ABI1 y PYL1) de la ruta de señalización de la fitohormona S - (+) - ácido abciso (ABA) de la planta que podría unirse a dCas9. En presencia de ABA, estos dominios se unirían para crear un archivo adjunto. El equipo de Wang se dio cuenta de que al fusionar los dominios dimerizables con los extremos de dCas9 y luego agregar ABA, sería posible generar una conexión entre dos regiones genómicas diferentes para formar un bucle de cromatina artificialmente inducido. Llaman a su sistema CRISPR / dCas9-ABA CLOuD9 (reorganización de bucles de cromatina usando cas9 de nucleasa deficiente) para abreviar.
Para probar CLOuD9, los autores primero analizaron si el método podría generar un ciclo de cromatina reversible dentro del locus de globina humana y entre Oct4 y un potenciador 5 'distal. En ambos casos, se generaron bucles de cromatina reversibles y se confirmaron usando la técnica 3C, con cada bucle dando como resultado un cambio en los niveles de expresión génica del gen de la β-globina u Oct4 . Es importante destacar que, cuando se eliminó ABA y las células se lavaron, las interacciones y el ciclo de la cromatina podrían revertirse.
Loopy por más tiempo
Con un sistema en funcionamiento, Wang y sus colegas hicieron otra pregunta: ¿cuánto tiempo podrían existir estos bucles de cromatina inducidos por ABA en las células? Sus datos iniciales mostraron que cuando ABA se eliminó a las 72 horas, las células perdieron sus bucles de cromatina. Pero los datos posteriores mostraron que, después de 10 días de tratamiento con ABA, las células realmente retuvieron los bucles de cromatina inducidos, incluso después de que el ABA fuera lavado. Para entender por qué este podría ser el caso, la espectrometría de masas se utilizó para observar las proteínas que rodean los bucles de cromatina a diferentes puntos de tiempo entre 72 horas y 10 días. Wang y sus colegas descubrieron que, a los 10 días, se estaban reclutando dos RNA helicases en los bucles de cromatina inducidos, probablemente trabajando para ayudar a mantener la estructura.
Al final, nuevos enfoques como CLOuD9, junto con técnicas establecidas como 3C, están creando un juego de herramientas epigenético más grande que permite a los biólogos descubrir nuevos conocimientos sobre las estructuras complejas y los mecanismos reguladores subyacentes a la estructura y función de la cromatina. Y los primeros resultados de CLOuD9 muestran claramente que a medida que este conjunto de herramientas crece y mejora, es probable que aprendamos datos aún más sorprendentes sobre cómo funciona la cromatina.
Referencia
1. Morgan, SL y col. 2017. Manipulación de la arquitectura nuclear a través del ciclo cromosómico mediado por CRISPR. Nature Communications , Número de artículo: 15993, doi: 10.1038 / ncomms15993
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